【簡述】
大黃素（3-甲基-1,6,8-三羥基蒽醌）是存在于掌葉大黃根和根莖中的活性成分之一。它已被證明含有多種作用（抗腫瘤，抗菌，利尿和血管舒張作用）。然而，大黃素的抗炎作用目前還沒有被證實。在這里，我們通過研究了大黃素對小鼠編號，看看大黃素是否真的存在抗炎作用。
【實驗材料】
本次實驗，我們總共選取了50只患有關節炎的雄性小鼠。將小鼠圈養在具有12小時光照/黑暗循環的層流柜中，并隨意維持在標準實驗室飼料中。所使用的大黃素來自成都格利普生物科技所生產（四川省成都市溫江區）。
【步驟】
1.破骨細胞分化
通過用α***小必需培養基沖洗長骨分離來自5周齡ICR小鼠的骨髓細胞，然后將細胞懸浮于補充有10％胎牛血清中；將細胞培養過夜。收集非貼壁細胞，在M-CSF的環境存在下培養3天。移除漂浮細胞并將貼壁細胞用作骨髓衍生的巨噬細胞。以3.5×10 4播種將細胞/孔置于48孔板中，并在存在或不存在大黃素的情況下用M-CSF和NF-κB配體的受體活化劑培養4天。通過染色抗酒石酸酸性磷酸酶活性來觀察破骨細胞。將陽性細胞計數為破骨細胞。
2.注射大黃素
用等體積的完全弗氏佐劑乳化的150μg牛II型膠原給小鼠注射。**次注射的當天定義為第0天。然后在第21天的時候用等量的在弗氏不完全佐劑中乳化的牛II型膠原注射小鼠，并在腹膜內注射脂多糖（30μg）。在每個實驗中使用兩組動物：一組動物在初次注射后第25至35天之間每隔一天腹膜內注射10mg / kg大黃素；另一組關節炎小鼠注射PBS代替大黃素。
接著，我們就可以對每一只小鼠的關節發炎程度評分，評分為0-3級：0級，無腫脹; 1級，輕微腫脹和紅斑; 2級，明顯腫脹; 3級，嚴重腫脹和/或關節僵硬。用***寬點處穿過踝關節放置的電動卡尺測量后爪厚度。將特定時間點的關節炎踝直徑的增加與第0天的直徑相比定義為爪厚度指數，并且該值以百分比表示。在第45天，殺死小鼠并從每只小鼠中提取滑膜組織。
3.細胞因子分析
為了確定患病小鼠的細胞因子水平，在第45天獲得血清和踝關節組織。通過在裂解緩沖液（組織蛋白提取試劑）中均質化關節從踝關節分離蛋白質提取物。。使用試劑盒測量血清丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶水平。
4.制備細胞質和核蛋白質提取物
關節組織通過離心操作后在PBS中洗滌兩次，然后沉淀5分鐘。用蛋白酶和磷酸酶抑制劑勻漿組織。使用NE-PER核和細胞質提取試劑從組織制備細胞質和核提取物。
5.電泳遷移率變動分析
將由關節組織制備的核提取物與蛋白酶抑制劑混合物一起溫育以抑制內源性蛋白酶活性。合成對應于NF-κB位點的寡核苷酸，將兩條互補鏈退火并用[α- 32標記]。標記的寡核苷酸，10μg核提取物和結合緩沖液在室溫下孵育30分鐘，***終體積為20μl。接下來，通過在0.5％硼酸鹽緩沖液中的4％聚丙烯酰胺凝膠上電泳來分析反應混合物。將凝膠干燥并通過放射自顯影檢查。通過使用50倍過量的未標記寡核苷酸的競爭測定證實了蛋白質-DNA相互作用對NF-κB的特異性。
6.蛋白質印跡分析
在蛋白質提取溶液中用蛋白酶和磷酸酶抑制劑將關節組織勻漿。含有30μg蛋白質的勻漿通過10％SDS-PAGE分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用1μg/ ml針對增殖細胞核抗原，β-肌動蛋白，探測印跡。。過氧化物酶綴合的抗兔或抗小鼠IgG用作二抗。
7.組織病理學評估
將關節??組織用10％福爾馬林固定，在10％EDTA中脫鈣3周，脫水并包埋在石蠟中。將切片（6μm）用蘇木精和曙紅（H＆E）或番紅O染色用于光學顯微鏡檢查。對關節切片的滑膜增殖，炎癥，軟骨損傷和骨侵蝕的變化進行評分，每個評分為0-4。為了研究具有CIA的小鼠中的破骨細胞骨吸收活性，將切片用TRAP染色試劑盒染色。在每個踝的10個區域（200×放大倍數）中計數含有三個或更多個細胞核的TRAP陽性多核細胞的總數。
8.射線照相評估
使用基于直接檢測平板陣列設計的X線照相成像儀，使用30kVp和90mA的曝光設置，獲得爪的平片。關節破壞程度和骨侵蝕評分為0-5：0，無損傷; 1，在一個開悟的部位觀察到輕微的骨質破壞; 2，適度變化，一個區域有兩到四個斑點; 3，在多個區域內有兩到四個斑點的顯著變化; 4，嚴重糜爛折磨關節; 5，完全破壞關節。
9.統計分析
數據表示為平均值± SEM。使用單因素方差分析進行統計學比較，然后進行事后分析。
【結果】
為了評價大黃素對小鼠的抗炎的作用，我們用CFA中的牛CII免疫小鼠，然后在初次免疫后第21天用IFA中的CII加強免疫。PBS處理的小鼠具有增加的疾病發病率并且發展出后爪的嚴重腫脹，紅斑和關節僵硬。相反，在用大黃素的小鼠中，CIA的發病率和嚴重程度顯著減弱。與PBS處理的小鼠相比，具有確定的關節炎臨床癥狀的小鼠的大黃素導致CIA的發病率和嚴重性逐漸降低，如通過臨床評分和爪腫脹所評估的。各組之間的體重變化沒有明顯差異。接下來，我們通過放射線照相證實了整個踝部區域的關節破壞。PBS處理的小鼠的后爪的射線照相顯示CIA的典型變化，關節破壞，關節移位和覆蓋整個踝區的不規則骨增生。然而，后爪的放射照相結果和平均放射學評分顯示大黃素處理的小鼠中的骨破壞明顯較少。組織病理學評估顯示踝關節的滑膜增生，軟骨損傷，炎性細胞浸潤和骨侵蝕。來自大黃素處理的小鼠的踝關節顯示出比PBS處理的小鼠顯著更少的炎癥和關節破壞。
【結論】
在這里已經表明，大黃素的確具有抗炎的作用，通過腹膜內注射大黃素，抑制了NF-κB的途徑在小鼠體內發揮抗炎作用，就能夠抑制小鼠的炎癥反應，并且大黃素還可能具有抵抗關節破壞的價值作用。
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